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    一氧化氮合酶免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時(shí)間： 2023-01-13　　點(diǎn)擊次數(shù)： 985次

    簡(jiǎn)介

    目前免疫組化多選用 SABC 法。

    一抗是特異性的針對(duì)檢測(cè)蛋白的單克隆或多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)為兔抗大鼠 iNOS ）。

     

    二抗是生物素標(biāo)記的針對(duì)一抗的抗體（本實(shí)驗(yàn)為羊抗兔 IgG ）。

     

    三抗是針對(duì)生物素的鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（streptavidin biotin complex，SABC）。

     

    這樣就可以通過逐級(jí)放大的方式，以過氧化物酶標(biāo)記要檢測(cè)的蛋白（iNOS）。顯色液為二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和雙氧水（H2O2）。

     

    顯色原理：過氧化物酶將 H2O2 分解，產(chǎn)生新態(tài)氧，使 DAB 氧化，生成棕黃色顆粒產(chǎn)物，可根據(jù)顏色反應(yīng)來判定一氧化氮合酶的有無或多少。本方法具有靈敏性高，背景低的優(yōu)點(diǎn)。

    原理

     一氧化氮合酶免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本原理是一氧化氮合酶按調(diào)控條件分為組構(gòu)型（cNOS）和誘生型（iNOS）。前者按細(xì)胞類型又可分為神經(jīng)元組構(gòu)型（nNOS）和內(nèi)皮細(xì)胞組構(gòu)型（eNOS）。前述的組化方法不能區(qū)分上述 NOS 的具體分型，因此可以利用針對(duì)不同類型 NOS（nNOS、eNOS、iNOS）的特異性抗體，通過免疫組化方法進(jìn)行顯示。

    材料與儀器

    器材：

    染色缸、載玻片、蓋片、吸管、吸水濾紙、小鑷子、解剖器材、灌注器材、石蠟切片機(jī)、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠或培養(yǎng)的細(xì)胞。

    試劑：
    ①兔抗大鼠 iNOS（一抗）
    ②羊抗兔 SABC 試劑盒［10％正常山羊血清、羊抗兔 IgG（二抗）、SABC（三抗）］
    ③3％H2O2-甲醇液
    ④0.01 mol ／ L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）
    ⑤0.01 mol ／ L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）
    ⑥ DAB 顯色液（DAB，6 mg ；0.05 mol ／ L PBS（pH 7.4），10 mL ；30％H2O2,0.01 mL 。過濾去除沉淀物。用時(shí)現(xiàn)配）
    ⑦雙氧水
    ⑧蘇木精染液
    ⑨梯度乙醇
    ⑩二甲苯
    ?4％多聚甲醛
    ?石蠟
    ?0.3％Triton X-100。

    步驟

    一氧化氮合酶免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本過程可分為如下幾步：

     

    （一）腦組織石蠟切片


    A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，常規(guī)包蠟塊。

    B．石蠟切片，片厚5 μm 。

    C．常規(guī)脫蠟入水。

    D．0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    E．封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3％H2O2-甲醇，室溫，15 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    F．抗原熱修復(fù)：將切片浸入0.01 mol ／ L 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），用微波爐或電爐熱處理（加熱至95 ℃ 后斷電，間隔5～10 min ，反復(fù)1～2 次 ）。自然冷卻后，在0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    G．封閉非特異抗原：向切片上滴加10％正常山羊血清，室溫或37 ℃ ，20～30 min 。甩去多余的血清，不洗。

    H．一抗孵育：滴加適當(dāng)稀釋的一抗（兔抗大鼠iNOS），放入濕盒中，4 ℃ ，過夜。以  PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    I．二抗孵育：滴加生物素化羊抗兔 IgG ，37 ℃ ，30 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    J．三抗孵育：滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），37 ℃ ，30 min 。0.01 mol ／ L PBS中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    K．顯色：用 DAB 顯色液顯色，顯微鏡下監(jiān)測(cè)，適時(shí)終止。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    L．蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。

    （二）細(xì)胞爬片或甩片


    A．細(xì)胞爬片或甩片，0.01 mol ／ L PBS 漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。0.01 mol ／ L PBS 漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    C．封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3％H2O2-甲醇，室溫，10 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    D．暴露抗原：0.3％Triton X-100，室溫，10 min 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    E．封閉非特異抗原：滴加10％正常山羊血清，室溫或37 ℃ ，20～30 min 。甩去多余的血清，不洗。

    F．一抗孵育：滴加適當(dāng)稀釋的一抗（兔抗大鼠iNOS），濕盒中，4 ℃ ，過夜。以不加 PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。0.01 mol ／ L PBS中 漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

     

    G．二抗孵育：滴加生物素化羊抗兔 IgG ，37 ℃ ，1 h 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。


    H．三抗孵育：滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），37 ℃ ，1 h 。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    I．顯色：用 DAB 顯色液顯色，顯微鏡下監(jiān)測(cè)，適時(shí)終止。0.01 mol ／ L PBS 中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

    J．蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。

    注意事項(xiàng)

    1．一抗的質(zhì)量是關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最關(guān)鍵因素，一定要選用高質(zhì)量的抗體。

    2．一抗、二抗、三抗的稀釋濃度、孵育時(shí)間、孵育溫度是十分重要的環(huán)節(jié)。在實(shí)際操作中，應(yīng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室的條件探索合適的制備方法。

     

    3．DAB 顯色液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，最早在使用前15 min 配制。

    4．實(shí)驗(yàn)操作過程中防止出現(xiàn)干片，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性。為了正確估計(jì)是否是因?yàn)椴僮鬟^程造成的人工假象，設(shè)立陰性對(duì)照十分必要。

    5．細(xì)胞爬片固定時(shí)采用室溫，是為了防止細(xì)胞脫落。以后每步操作都要小心，防止細(xì)胞脫落。

     

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